免疫缺陷动物模型--人源化小鼠

复杂的生物过程通常需要在个体水平上（体内）进行研究和分析，显然多数介入性生物学研究不能以人类为实验对象。小鼠无疑是生物学和医学领域最常用的实验动物模型，然而，小鼠毕竟不是人类，也无法完全替代人类。免疫缺陷小鼠出现后，使得通过移植人体免疫组织或细胞到其体内构建人鼠嵌合模型，既人源化免疫系统小鼠（人源化小鼠）成为可能。自1988年首次成功将人体造血细胞移植到重症联合免疫缺陷(C.B-17/scid，简称SCID)小鼠算起，人源化小鼠培育历经了三十余年的发展。当下，人源化小鼠模型已成为人类造血功能、先天性和适应性免疫、自身免疫、传染病、癌症生物学和再生医学等领域的重要模型工具。本篇将在本号已推出的裸鼠、SCID小鼠和NOD小鼠三篇文字基础上，从实验动物培育的角度向读者朋友们介绍人源化小鼠的培育历程。

第一个突破 SCID小鼠的出现

无胸腺裸鼠因携带纯合Foxn1nu突变致胸腺发育不良而缺乏成熟的T细胞和依赖T细胞的免疫排斥反应。但由于其仍具有B细胞和NK细胞，因此无法作为人源化小鼠模型的受体动物。SCID小鼠因携带Prkdcscid纯合突变（scid突变）导致T细胞和B细胞均存在成熟缺陷，令部分人体细胞可以在该小鼠上存活。藉此，早在1988年就已成功将人外周血单核细胞（PBMC）和人造血干细胞（HSCs）移植给SCID小鼠构建了人源化SCID小鼠模型，因此可以把SCID小鼠的出现视为人源化小鼠模型培育的第一个突破。

然而基于SCID的人源化小鼠模型存在着如下缺点：

（1）植入的人体细胞在SCID小鼠体内重建水平非常低，且不能产生功能性免疫系统；
（2）SCID小鼠存在渗漏现象，随着年龄的增长，会部分恢复T和B细胞功能；
（3）SCID小鼠体内自然杀伤（NK）细胞和其他先天免疫活性处于高水平，限制了HSCs的植入成功率；
（4）移植时为了清除SCID小鼠内源造血干细胞，需要对其进行半致死剂量的放射性辐照，而scid突变产生DNA损伤修复缺陷，导致其抗辐照能力差。

基于这些原因，在人源化小鼠培育上还需要寻找新的突破，而第二个突破来自于将scid突变导入到非肥胖糖尿病（Nonobese diabetes: NOD）小鼠中。

第二个突破 NOD/scid小鼠的培育成功

在本号前文《免疫缺陷动物模型---NOD小鼠》中已经介绍NOD小鼠不仅血糖代谢异常，还存在包括NK细胞功能和补体（C5）功能在内的多种免疫缺陷。通过与SCID小鼠杂交后，在连续用NOD小鼠回交（10代以上）后得到scid突变纯合的同源导入近交系（congenic inbreed strain）NOD.Cg-Prkdcscid小鼠（简称NOD/scid小鼠）。在遗传组成上NOD/scid小鼠与NOD小鼠的唯一不同就是Prkdc这个位点，前者携带纯合的scid突变，而后者为野生型。NOD/scid小鼠不仅没有了NOD小鼠的自发糖尿病和胰岛炎表型（读者朋友可以分析一下其原因），且与包括C3H/scid、C57BL /6-scid在内的scid突变同源导入近交小鼠和scid突变来源的CB.17/scid小鼠相比还具有支持更高水平人体造血细胞植入的能力。研究表明，NOD/scid小鼠的人源细胞移植水平比其它品系scid突变小鼠高5-10倍。因此，可以说NOD/scid小鼠是人源化小鼠培育工作的第二个突破。

NOD/scid小鼠的培育成功不仅推动了人源化小鼠模型的广泛使用，也为进一步优化人源化小鼠提供了方向。但NOD/scid小鼠同样存在着诸多不足，主要表现为：

（1）因自发淋巴瘤致其平均寿命仅有8个月；
（2）NK细胞仍具有一定活性，同时免疫渗漏问题也未得到解决；
（3） scid突变导致的抗辐照能力弱问题依然存在。

上述缺陷说明人源化小鼠模型培育工作仍有很大的提升空间。

第三个突破极重度免疫缺陷小鼠的培育成功

当给NOD/scid小鼠注射NK细胞发育相关抗体阻断NK发育后，可以提高其人体造血细胞移植水平，说明残留的NK细胞活性仍然是影响NOD/scid小鼠人造血细胞移植能力的主要因素之一。如果将残余的NK细胞活性全部消除，是不是可以进一步提升NOD/scid小鼠的人类造血细胞移植能力呢？随着小鼠遗传操纵技术的成熟，科学家几乎可以构建任意基因和任意类型遗传突变的小鼠模型。在此背景下，不同突变类型的白细胞介素2受体（IL-2R）γ链基因（IL2rg）敲除小鼠被相继构建成功，为人源化小鼠培育带来了新的突破。

IL-2R γ链是白细胞介素（Interleukin，简称IL）家族IL-2，IL-4，IL-7，IL-9，IL-15和IL-21高亲和力受体的关键组成部分，为受体传导这些细胞因子信号所必需。IL-2Rγ链的缺失会导致T细胞、B细胞发育和功能严重受损，并完全阻止了NK细胞的发育。因此，在NOD/scid背景下通过引入IL2rg突变后就可以形成T，B和NK三种细胞同时功能缺失的小鼠。在这个思路指引下，日本东京大学和美国Jackson实验室先后培育了NOG、NSG和NRG等极重度免疫缺陷小鼠。

NSG是商品名NOD scid gamma (NSG™)的简称，其正式名称为NOD.Cg-Prdkcscid IL2rgtm1wjl/ShiLtSzJ，由Jackson实验室以雌性NOD/scid与雄性IL2rg基因敲除小鼠B6.129S4-Il2rgtm1Wjl/J交配后，再用NOD/scid小鼠回交8代后的子代近交培育而成的同源导入近交系。NOG是NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Sug/ShiJic简称，由日本东京大学实验动物中心培育。NOG是比NSG更早开发出来的极重度免疫缺陷小鼠，与NSG最大的区别在于IL2rg位点。NOG导入了一个截短的IL2rg基因（缺乏胞内段，可以结合细胞因子，但不能传递信号），NSG导入的是一个完全删除的IL2rg基因。除此之外，NOG的培育使用的是日本保有的NOD/Shi-scid,小鼠，而NSG的培育使用的是Jackson实验室保有的NOD/Lt-scid小鼠，这也可能会给二者带来一些差异，如在人体脐带血移植能力上NSG小鼠略高于NOG小鼠，体重上NSG小鼠整体上要比NOG小鼠重一些。在主要的免疫学性状上二者高度相似，都是缺少功能性T、B和NK淋巴细胞，同时存在巨噬细胞和补体功能缺陷。

NSG和NOG小鼠很少自发淋巴瘤，现有研究数据显示NOG和NSG小鼠的胸腺瘤发病率不足1%，而NOD/scid的发病率高达67%。因此，低自发淋巴瘤的NSG和NOG小鼠是长寿的，不会像NOD/scid小鼠那样只有不到8个月的寿命。需要注意的是小鼠的Il2rg基因位于X染色体上，雌性NSG小鼠为Il2rgtm1Wjl纯合子，雄性小鼠为Il2rgtm1Wjl半合子。

为了解决scid突变导致小鼠抗辐照能力弱的问题，Jackson实验室又培育了NOD.Cg-Rag1tm1Mom IL2rgtm1Wjl/SzJ 小鼠(简称NRG)。与NSG和NOG不同的是，NRG的T、B细胞功能缺失是由免疫细胞成熟发育的另一个关键基因-重组激活基因（Recombination activating gene 1， Rag1）突变所致。因Rag1基因突变不影响DNA损伤修复，所以NRG小鼠不存在因携带scid突变导致的抗辐照能力差问题，理论上NRG是一款比NOG和NSG更好的极重度免疫缺陷小鼠。

与所有先前培育的免疫缺陷小鼠模型相比，引入IL2rg突变的免疫缺陷小鼠极大地增加了对人体造血细胞的植入能力，也令NOG、NSG和NRG等成为人源化小鼠模型构建中最常用受体动物，它们不仅能够支持大量人类免疫细胞的长期植入和稳定存在，还能形成部分人类造血功能。可以把把IL2rgnull突变的引入，并藉此培育出NOG、NSG和NRG等极重度免疫缺陷小鼠视作人源化小鼠培育的第三个突破。

在人源化小鼠培育上，美国和日本科学家一直是你追我赶又互通有无地比拼着。美国的Jackson实验室先于日本培育出了NOD/scid小鼠，但日本的东京大学却先于美国培育出了含Il2rg基因功能缺失突变的NOG小鼠（2002年NOG，2005年NSG），随后美国科学家（来自Jackson实验室）又培育出了抗辐照的NRG小鼠。中国的百奥赛图公司于2015年通过基因编辑技术直接将NOD/scid小鼠的Il2rg基因突变掉（大片段删除），也获得了类似NOG和NSG的极重度免疫缺陷小鼠NOD-Prkdcscid IL2rgtm1/Bcgen小鼠，商品名为B-NDG®。生长曲线上B-NDG®与NSG类似，由于B-NDG®的Il2rg突变是在NOD/scid小鼠上直接实施的，而不同于利用同源导入的方式引入Il2rg突变的NSG和NOG，因此其具有更高的NOD背景纯度。

由于人类免疫细胞和小鼠微环境之间存在物种屏障，因此人源化小鼠只能部分重构人体免疫功能。为此，通过遗传操作技术将人类免疫调控相关基因（如细胞因子，人类主要组织相容性抗原等）转到NSG等免疫缺陷小鼠体内，实现对其微环境的改造，令其更好地支持人体免疫功能重建，将是未来人源化小鼠培育的新方向。

参考文献

1. Greiner DL, Shultz LD, Yates J, et al. Improved engraftment of human spleen cells in NOD/LtSz-scid/scid mice as compared with C.B-17-scid/scid mice. Am J Pathol. 1995;146:888-902.

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